血清中CDO1基因与HOXA9基因启动子甲基化高表达在卵巢癌诊断中的意义

方法 收集2022年1月至2023年10月就诊于成都市妇女儿童中心医院妇科有卵巢肿块手术指征患者作为研究对象进行病例对照研究。术前采集血液进行血癌抗原125（CA125）、人附睾蛋白4（HE4）、卵巢恶性肿瘤风险算法（ROMA）指数评估及DNA甲基化检测。同时收集患者基本临床信息、生物标记物与经阴道超声（TVS）等信息。共收集151例研究对象，其中病理检查良性122例，卵巢癌29例。以腹腔镜下卵巢组织病理学诊断为金标准，采用多因素Logistic回归分析卵巢癌的高危因素，利用受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析DNA甲基化检测对卵巢癌的临床检测效能

结果 卵巢癌患者组的年龄、绝经状态、CA125与HE4检测、ROMA指数、CDO1基因与HOXA9基因单独或联合检测的阳性率均高于良性组（ P 对象与方法 一、对象 收集2022年11月至2023年10月就诊于成都市妇女儿童中心医院妇科有卵巢肿块手术指征患者作为研究对象进行病例对照研究。 纳入标准：年龄18周岁，根据临床表现和检查考虑为盆腔包块将进行腹腔镜检查及活检；既往未因生殖道肿瘤接受过任何治疗或手术治疗；愿意受检测并签署知情同意书；腹腔镜前评估未发现女性生殖道癌。 排除标准：无法获取卵巢病理信息者。根据本研究的入组流程，最终共有151例患者满足入组条件，包括29例卵巢癌患者（卵巢癌组）与122例卵巢良性病变组（良性组）。卵巢癌包括浆液腺癌13例、内膜样腺癌7例、转移癌3例、透明细胞癌2例、卵巢癌未分2例、黏液性腺癌1例、癌肉瘤1例。国际妇产科联盟（The International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：I期12例、Ⅱ期2例、Ⅲ期9例、Ⅳ期1例、未分类2例、与转移癌3例。本研究通过本院伦理委员会审批，成都市妇女儿童中心医院［科研伦审2022（55）号］。 二、方法 1.试剂与仪器：糖类抗原125（cancer antigen 125，CA125）、人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）检测试剂和电化学发光免疫分析仪购自德国罗氏诊断公司；血浆游离DNA管购自中国广东国盛医学科技有限公司；DNA提取试剂盒、重亚硫酸盐转化试剂盒和卵巢癌甲基化引物探针试剂购自中国北京起源聚禾生物科技有限公司。 2.血清CA125和HE4水平检测：采集患者血清样本，使用罗氏Cobas E602电化学发光免疫分析仪及其配套试剂按照仪器和试剂的说明书进行检测。CA125的测量范围为0.6~5 000 U/ml，正常参考值为 3.卵巢恶性肿瘤风险算法（risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA指数）指数计算：使用罗氏电化学发光免疫分析仪自带软件，根据CA125和HE4的分析结果，计算绝经前和绝经后患者的ROMA值。ROMA值（%）=exp（PI）/［1+exp（PI）］×100%，其中PI 计算如下：（1）绝经前PI=‒12.0+2.38×LN（HE4）+0.0626×LN（CA125）；（2）绝经后PI=‒8.09+1.04×LN（HE4）+0.732×LN（CA125）。 4.外周血中游离DNA甲基化检测及判断：所有实验样本收集均遵循以下步骤：参与者在腹腔镜前一天抽取5 ml外周静脉血保存于血浆游离DNA管，采血完成后72 h内分离血浆。血浆离心分离后使用DNA提取试剂盒进行游离DNA提取，使用重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐转化，使用转化完成的DNA（Bis-DNA）进行扩增检测。反应条件：预变性96 ℃ 10 min；45个循环，变性94 ℃ 15 s，退火64 ℃ 5 s，延伸、荧光采集60 ℃ 30 s；仪器冷却25 ℃ 1 min。反应结束后根据CDO1基因、HOXA9基因的Ct值进行判读，内参基因Ct GAPDH≤34.6值时依据CtCDO1 本研究纳入的所有患者均经过了系统的临床基本信息收集，包括影像学检查结果。此外，还对每位患者进行了生物标志物（包括血清CA125和HE4）的检测，并据此评估了ROMA指数。患者的腹腔镜检查由成都市妇女儿童中心医院具有相关资质的医生在静脉麻醉下完成，根据病情对卵巢及病变处进行活检。 三、统计学分析 使用R软件（4.3.1）进行统计分析。对于符合正态分布的连续变量，使用进行描述，并通过方差分析方法比较不同组之间的差异。非正态分布的连续变量用 M（ Q 1， Q 3）表示，两组间差异的比较采用Mann-Whitney U检验。对于分类变量，使用Fisher精确概率法来检验不同组之间的构成比差异。使用多因素Logistic回归分析卵巢癌发生的相关因素。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积（area under curve，AUC）评估各指标诊断卵巢癌的效果，并计算敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、比值比（odd ratios， OR）及 95%可信区间（confidence interval， CI）。所有检验双侧α=0.05

结果 一、临床特征信息与单因素分析 卵巢癌组的年龄、绝经状态、CA125与HE4检测、ROMA指数、CDO1基因与HOXA9基因单独或联合检测的阳性率均显著高于良性组（ P 二、多因素Logistic回归分析 纳入年龄、绝经状态、ROMA指数和CDO1/HOXA9双基因甲基化检测结果进行Logistic回归分析发现，ROMA指数和CDO1/HOXA9双基因甲基化检测的 OR值分别为1.31（95% CI 1.062～1.702）与31.75（95% CI 1.843～1 084.312）， P分别为0.022和0.024。在调整年龄、绝经情况、ROMA指数后，CDO1/HOXA9双基因甲基化阳性者发生卵巢癌的概率是甲基化阴性者的31.75倍（ 表2 ）。 三、各参数单项及联合诊断卵巢癌的临床效能 单项与双项联合检测诊